CRISPR’dan Önce Gen Düzenleme: ZFN ve TALEN

Gen düzenlemesi, yaşamın kodu olan DNA üzerinde kalıcı değişiklikler yapılmasıdır. Bu yöntem sayesinde genlerin işlevlerinin açığa çıkarılması ve genetik hastalıkların temellerinin araştırılması gibi konularda çalışmalar yürütülebilir. Bunun yanında kişiselleştirilmiş tedaviler için büyük bir potansiyel taşımaktadır.

Nükleazlar, nükleik asitleri (DNA ve RNA) kısmen ya da tamamen parçalayan enzimlerdir. Bunu, DNA üzerinde çift zincir kırıkları [ing. double-strand breaks (DSBs)] oluşturarak gerçekleştirirler. Bu kırıklar hücre tarafından iki şekilde onarılabilir: donör DNA yardımıyla gerçekleşen homolog onarım [ing. homology directed repair (HDR)] veya hataya daha eğilimli olan homolog olmayan uç birleştirme [ing. nonhomologous end joining (NHEJ)].

Bu iki yöntemle nükleaz hasarının hücreler tarafından etkili bir şekilde onarıldığı görülünce bu mekanizmanın gen düzenlemesi için kullanılabileceği fark edildi. Nükleazların hedefli bir şekilde belli bir DNA bölgesini kesmesi sağlanabilirse düzenleme işlemi gerçekleşecekti. Böylece hedefleme vektörü ve seçim basamağı gerektirmeden genetik değişiklik kolayca yapılabilir.

Bu şekilde DNA onarımını tetikleyen genom düzenleme araçları beş gruba ayrılmaktadır: cas9-tipi enzimler, TALEN, ZFN, mega-TAL ve meganükleazlar[1].

Gen düzenleme deyince aklınıza hemen CRISPR/Cas9 geliyor olabilir ama bugün birlikte onun yarattığı devrimden öncesine yolculuk yapacağız. ZFN ve TALEN platformlarını daha yakından tanıyacağız.

Çinko parmak nükleazları [ing. Zinc finger nucleases (ZFN)] ve transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar [ing. transcription activator-like effector nucleases (TALEN)] oldukça benzer bir yapıya sahiptir. İkisi de DNA bağlanma ve kesme bölgesi olmak üzere iki bileşenden oluşur.

Basitçe programlanabilen DNA bağlanma modülüne bağlı FokI nükleazdan oluşmaktadırlar. FokI enzimi tek başına yeterli değildir çünkü bu enzim DNA’nın belli bölgesine özgü kesim yapmaz. Bu enzimin hedeflenmesi için DNA bağlanma modülleri kullanılır. Bu modül; ZFN için zinc finger proteini (ZFP), TALEN içinse transcription activator-like efector (TALE) proteinlerdir .

ZFP’ler üçlü nükleotid dizilerini tanırlar. Daha geniş bir alanın tanınması ve kesinliğin artırılması için birden fazla ZFP zincir olarak kullanılır. TALE proteinleri ZFP’lerden farklı olarak tek bir nüklotide bağlanmaktadır. Onların da aynı şekilde zincir olarak tasarlanması gerekir.

Bu noktada “FokI enzimin DNA’nın rastgele bir bölgesini kesmesi nasıl engelleniyor?” diye sorulabilir.

Bunu engellemek için FokI enzimin dimerik yapıda aktifleşmesinden yararlanılır. FokI enzimi iki monomer kısımdan oluşan dimerik yapıda bir enzimdir ve sadece bu iki monomer bir aradayken aktivite gösterir.

Primer tasarımına benzer şekilde, ZFP ve TALE protein zincirleri sağ ve sol olmak üzere iki DNA zinciri için özel tasarlanır. Bunlara bağlayıcı (linker) bir grupla FokI monomeri bağlanır. Sağ ve sol ZFP ve TALE proteinleri DNA’ya bağlandıktan sonra kesim kısmında FokI enziminin iki monomeri, dimer oluşturarak aktifleşir [Şekil 1]. Bunu basitçe iki yapboz parçasının birleşmesi gibi düşünebilirsiniz. Aktifleşen fokI enzimi DNA’nın istenen bölgesinde DSB oluşturur.

Şekil 1. ZFN ve TALEN gen düzenleme platformları. Sağ ve sol (1a) ZFN ve (1b) TALEN ve FokI enzimin dimerleşmesi görselleştirmiştir[2]. (2a) ZFN ve (2b) TALEN platformun ve kesim bölgesinin daha detaylı gösterimi görülmektedir[3].

Her iki sistemde de DNA’da çift zincir kırıkları oluştu. Peki şimdi ne olacak?

Şimdi sıra sevgili hücremizde. Donör DNA’nın varlığına bağlı olarak NHEJ veya HDR çift zincirli onarım yöntemlerinden biriyle bu kırığı onaracaktır. Verilen donör yeni bir gen içeriyorsa gen eklenmesi (gene insertion), aynı genin düzeltilmiş kopyasını içeriyorsa da gen düzeltilmesi (gene correction) gerçekleşir. Her ikisi de homolog onarımla gerçekleşir. Eğer donör yoksa gen silinmesi (gene deletion) veya hataya eğilimli NHEJ onarımı gerçekleşecektir [Şekil 2]. İstenilen genetik değişikliğe bağlı olarak bu olası durumlardan biri tercih edilmeli ve ona uygun şekilde ZFN veya TALEN platformu tasarlanmalıdır.

Şekil 2. Çift zincirli DNA kırıklarının (a) NHEJ ve (b) HDR ile onarımı[4]

2012 yılında CRISPR’ın ortaya çıkışıyla geri planda kalan bu iki tekniği öğrenme yolculuğumuz burada sona eriyor. Yeni yazılarda görüşmek dileğiyle…

Sorularınız, önerileriniz ve bana kendimi geliştirmemde yardımcı olacak yapıcı eleştirilerinizi bekliyorum. Bana LinkedIn platformu aracılığıyla ulaşabilirsiniz.

Gamze Karakaş - Research Intern at MU| Graduation student at ITU| LinkedIn

Kaynaklar:

[1] Urnov, F. D. (2018). Genome Editing BC (before CRISPR): lasting lessons from the “old testament”. The CRISPR Journal, 1(1), 34–46.

[2] Shim, G., Kim, D., Park, G. T., Jin, H., Suh, S. K., & Oh, Y. K. (2017). Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica, 38(6), 738–753.

[3] Gaj, T., Gersbach, C. A., & Barbas III, C. F. (2013). ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology, 31(7), 397–405.

[4] Li, H., Yang, Y., Hong, W., Huang, M., Wu, M., & Zhao, X. (2020). Applications of genome editing technology in the targeted therapy of human diseases: mechanisms, advances and prospects. Signal transduction and targeted therapy, 5(1), 1–23.

Öneri:

- Gen Düzenleme Çeşitleri: CRISPR, ZFN, TALEN [video], Bioinforange.