CRISPR’a Giriş
CRISPR ya da tam adıyla Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (Düzenli aralıklarla bölünmüş palindromik tekrar kümeleri), Nobel Komitesinin dünyaya duyurduğu şekliyle (“Rewrite the code of life”) yaşamın kodunun yani DNA’nın yeniden yazılmasını sağlayan bir genom düzenleme aracıdır. Daha basitleştirerek kendisine genetik makas da diyebiliriz.
Aslında CRISPR’dan önce, ona benzer şekilde DNA onarımını tetikleyen ZFN ve TALEN’lerle gen düzenlemesi yapılabiliyordu ama bu yöntemler oldukça verimsizdi. Öyleki Stanford Üniversitesinde Profesor Matt Porteus’un aktardığına göre %1–2 olan doğrululuk oranı CRISPR’la %50–70’e kadar yükseltildi. Kısaca CRISPR-Cas9 teknolojisinin DNA üzerinde değişiklik yapmayı nispeten daha kolay ve ucuz hale getirdiğini söyleyebiliriz.
CRISPR’dan önceki gen düzenleme araçlarını merak edenleri buraya davet ediyorum. Biz de CRISPR/Cas9 sisteminin yapısına doğru kısa bir yolculuğa çıkalım.
CRISPR DNA’sı basitçe iki bileşenden oluşur: palindromik tekrar eden CRISPR olarak adlandırılmış DNA sekansları ve bunların arasında bulunan virüs DNA’sıyla örtüşen, değişken spacer (aralayıcı) olarak adlandırılmış DNA sekansları. CRISPR dizisi olarak adlandırılan bu bölgenin üst kısmında ise cas9 ve tracrRNA’ı kodlayan sekanslar bulunmaktadır.
Bu bölgeyle kodlanan CRISPR/Cas9 kompleksi üç ana yapıdan oluşmaktadır. Bunlar CRISPR RNAsı (cRNA), tracrRNA ve cas9 enzimidir. Laboratuvar uygulamaları için cRNA ve tracrRNA baz alınarak dizayn edilen RNA’lar, rehber RNA (guide RNA) olarak adlandırılmaktadır.
CRISPR’ın yapısına yaptığımız bu kısa bakıştan sonra gelelim işlevine.
Hep CRISPR’ın doğadaki ve laboratuvardaki işlevini ayrı ayrı irdelemenin daha açıklayıcı olduğunu düşündüm. Bugün de size bu şekilde aktarmak istiyorum.
Doğada CRISPR,
bakterilerin virüslere karşı kendilerini savunmasında rol oynar. Biliyorum bugünlerde virüslerden çok çektik ama bilmenizi isterim ki bu konuda yalnız değiliz. Bakteriler de bakteriofaj olarak adlandırılan virüslerden muzdarip ve aralarındaki kadim savaş devam etmekte.
Bir bakteriofaj, bakteriye tutunup kendi DNA’sını bakterinin içine aktarmasıyla bir nevi saatli bomba kurulmuş olur. Bu atak savuşturulamazsa bakteriofaj, konak bakteri hücresinin kaynaklarını kullanarak kendini çoğaltır ve nihayetinde konak hücreyi patlatır. Böylece hücre dışına çıkan bakteriofajlar, yeni konak hücre arayışlarına başlarlar. Bu süreç, litik döngü olarak adlandırılmaktadır.
Neyseki bakteriler bu kadim savaşı kendi lehlerine çevirebilecek bir koruyucu bağışıklık sistemine sahip: CRISPR.
Bakterilerin DNA’sında yer alan CRISPR dizisi, önceki enfeksiyonlarından toplanan virüs DNA’larını içerir.
DNA’sı CRISPR dizinde olmayan bir virüs bakteriyi enfekte ettiğinde, cas1 ve cas2’nin oluşturduğu protein kompleksi bu viral DNA’dan belli bir uzunluktaki bir segment çıkarır. Protospacer olarak adlandırılan bu segment, CRISPR dizisinin önüne eklenir. Artık sevgili bakterimiz bu virüse karşı savunmasız değildir. Yeniden aynı tür virüs gelirse, eklenen spacer’i içeren cas9 proteini kırmızı kabloyu keserek bombayı etkisizleştirir.
Cas9’ı polis olarak düşünebiliriz ve elinde ise aradığı suçlunun robot resmi (cRNA) vardır. Basitçe cas9, virüs DNA’sını tarar ve elindeki resimle eşleştiğini görürse onu keserek etkisiz hale getirir.
Bunun için önce CRISPR dizisinden CRISPR RNA’sı oluşturulur. Sonra tracrRNA gelerek cRNA ile bağlantı kurar. Daha sonra da cas9 proteini bu ikili RNA kompleksi ile birleşerek yapısını tamamlar. Böylece cas9 elindeki sekansla eşleşen DNA parçalarını aramaya başlar.
Aslında ilk etapta aradığı sadece PAM olarak adlandırılan kısa bir DNA dizisidir. Cas9 tüm DNA’yı açarak eşleşme aramak yerine PAM sekansını olduğu kısmı açar. Eğer cRNA ile eşleşme bulursa PAM sekansının 3–4 nükleotid aşağısından DNA’da çift zincir kırığı oluşturur.
Bakterilerin kazanılmış bağışıklık sistemi CRISPR, gen düzenleme aracı olarak nasıl kullanılıyor?
Bunun için öncelikle yapısını biraz daha basitleştirmek adına cRNA ve tracrRNA’ın birleştirilmiş hali olan rehber RNA’yı kullanmalıyız. (Bölgece bileşen sayımız üçten ikiye düşmüş oluyor: cas9 ve rehber RNA.)
Bu rehber RNA’na değişiklik yapmak istediğimiz bölgeye göre tasarlanıyor.
Eğer amacımız sadece bir geni inaktif hale getirmekse, Cas9’in o geni kesmesini sağlamamız yeterli olacaktır. DNA onarımında sıkça yapılan hatalardan dolayı istenilen gen mutasyona uğrayarak inaktif olacaktır. Eğer yeni bir gen eklemek veya hatalı bir geni düzeltmek istiyorsak, bu sefer sisteme dönor DNA’yı da dahil etmeliyiz. Böylece bu DNA parçası, DNA onarımı sırasında kalıp görevi görecektir.
CRISPR birçok organizmaya uygulanabilen ve programlanabilen bir teknik. Bu özellikleri sayesinde hücre ve hayvan modellerinin oluşturulması, genetik hastalıklarının tedavisi, nükleik görüntüleme/tanı, yeni ilaçların seçimi, tarım gibi birçok alana uyarlanabilmektedir. Tüm bu avantajlarının yanında hala geliştirilmelerine devam edilen bir teknik olduğunu da unutmamak gerekir.
CRISPR/Cas9 teknolojisine yaptığımız detaylı giriş burada sona eriyor. Yeni yazılarda görüşmek dileğiyle…
Sorularınızı, önerilerinizi ve bana kendimi geliştirmemde yardımcı olacak yapıcı eleştirilerinizi bekliyorum. Bana LinkedIn platformu aracılığıyla ulaşabilirsiniz.
Kaynaklar;
[1] Lander, E. S. (2016). The heroes of CRISPR. Cell, 164(1–2), 18–28.
[2] Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2012). A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. science, 337(6096), 816–821.
[3] The Lytic Cycle, https://courses.lumenlearning.com/microbiology/chapter/the-viral-life-cycle/].
[4] You, L., Tong, R., Li, M., Liu, Y., Xue, J., & Lu, Y. (2019). Advancements and obstacles of CRISPR-Cas9 technology in translational research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 13, 359–370.
Tavsiyeler;
Belgesel
· Human Nature [Netflix]
· Unnatural Selection [Netflix]
Kitap
· Yaratılıştaki Çatlak — Jennifer A. Doudna & Samuel H. Sternberg
Video
· Genome Editing with CRISPR-Cas9 [youtube], McGovern Institute.
· How CRISPR lets us edit our DNA — Jennifer Doudna[youtube], TED.
