Cas9, Virüs DNA’sı İçerdiği Halde Bakteri Genomunu Neden Kesmiyor?
Cevabı kendisi küçük etkisi büyük PAM dizisinde saklı
Bildiğiniz üzere CRISPR/Cas9, bakteriler için kazanılmış bağışıklık sistemi. Virüslere karşı kendilerini savunmalarında rol oynuyor ve bunu önceki virüs enfeksiyonlarında genomuna entegre ettiği virüs DNA parçaları (spacer) ile gerçekleştiriyor[1].
[detaylar için buradan CRISPR’a giriş yazıma ulaşabilirsiniz]
Peki bu sekansları hedef alan ve kesen cas9 enzimi, bakterinin kendi DNA’sında da bu sekanslar bulunduğu halde nasıl oluyor da onu kesmiyor?
Bu ilginç sorunun kısa bir cevabı var: PAM dizisi.
Protospacer bitişik motif (PAM), hedeflenen DNA bölgesininden sonra gelen ve genellikle 2–5 baz çifti uzunluğundaki kısa bir DNA dizisidir[3]. Cas9 enziminin ilk etapta aradığı dizidir. Bu dizinin bulunduğu yerde cas9, cDNA eşleşmesini control eder ve bulursa PAM sekansının 3–4 nükleotid aşağısından DNA’yı keser[4].
PAM sekansı, cas9 enziminin üretildiği bakteriye bağlı olarak değişiklik göstermektedir. Aşağıdaki tabloda bazı PAM sekansları ve izole edildikleri organizmalar görülmektedir.
Viral DNA’dan CRISPR dizisinde depolanması için parçalar kesilirken, PAM sekansı dahil edilmez. Böylece CRISPR dizisindeki spacer bölgeleri, PAM sekansını içermecektir.
Hedeflerini tanımak için PAM sekansına ihtiyaç duyan Cas9, her ne kadar virüs DNA’sı içerse de bakteri genomunu bir hedef olarak tanımaz. Aynı şekilde araştırmalar için tasarlanacak rehber RNA (gRNA)’larda bu mantığı takip ederek PAM dizisini içermemelidir[7].
Cas9 enziminin PAM dizisine gereksinimi, bakteri genomunu korumak için yararlı olsa da genom düzenlemede büyük bir dezavantaj oluşturur. Doğada bulunan cas9 enzimlerinin PAM sekans tercihlerinin sınırlı olması, bazı DNA bölgelerinde düzenleme yapılamamasına neden olur. Ama bu dezavantajın ortadan kaldırılması için, araştırmacılar farklı PAM sekans tercihlerine sahip Cas proteinlerini protein mühendisliği yardımıyla geliştirebilmektedir[8].
Kendisi küçük olsa da önemi oldukça büyük olan PAM sekansını tanımış olduk. Rehber RNA’nızı tasarlarken bu tatlı, minik sekansı sakın unutmayın. Yeni yazılarda görüşmek dileğiyle…
Sorularınızı, önerilerinizi ve bana kendimi geliştirmemde yardımcı olacak yapıcı eleştirilerinizi bekliyorum. Bana LinkedIn platformu aracılığıyla ulaşabilirsiniz.
Kaynaklar:
[1] Lander, E. S. (2016). The heroes of CRISPR. Cell, 164(1–2), 18–28.
[2] CRISPR Frequently Asked Questions [online], IDT.
[3] Shah, S. A., Erdmann, S., Mojica, F. J., & Garrett, R. A. (2013). Protospacer recognition motifs: mixed identities and functional diversity. RNA biology, 10(5), 891–899.
[4] Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A., & Jinek, M. (2014). Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature, 513(7519), 569–573.
[5] Importance of the PAM Sequence in CRISPR Experiments [online], Synthego
[6] Jamal, M., Khan, F. A., Da, L., Habib, Z., Dai, J., & Cao, G. (2015). Keeping CRISPR/Cas on-target. Curr Issues Mol Biol, 20, 1–20.
[7] Leenay, R. T., & Beisel, C. L. (2017). Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. Journal of molecular biology, 429(2), 177–191.
[8] Tang, L. (2020). PAM-less is more. Nature Methods, 17(6), 559–559.
Öneri:
· What is the PAM? — A CRISPR Whiteboard Lesson [youtube]- Innovative Genomics Institute — IGI.
